污水生物处理过程氧化亚氮的形成及减量工艺
随着全球变暖问题越来越受到人们的关注，减臭氧发生化学反应，从而破坏臭氧层。N2O的产生来源于自然过程和人为排放。自然排放源占57%，主要包括海洋和土壤微生物的活动；人为排放源占43%，主要包括农田氮肥施用、化石燃料燃烧、废弃物和废水生物转化、生物质燃烧等。
生物脱氮是污水处理厂常见的脱氮工艺，N2O会在生物脱氮过程中产生。研究发现在硝化阶段和反硝化阶段都会产生N2O，硝化过程中N2O来自羟胺（NH2OH）少温室气体的排放和增加温室气体的吸收正成为研究热点。氧化亚氮（N2O）是《联合国气候变化框架公约》京都议定书中规定控制的6种温室气体之一，其温室效应作用力是二氧化碳（CO2）的298倍，N2O扩散进入平流层会与的不完全氧化，而反硝化过程中N2O作为反硝化的中间产物被释放出来。虽然反硝化过程会造成N2O的释放，但是完全反硝化过程可以将N2O还原为氮气（N2），所以其也被认为是目前为止污水处理过程N2O唯一的汇。
生物脱氮过程离不开微生物的参与，能够进行硝化反应的微生物包括氨氧化细菌（ammonia-oxidizingbacterium，AOB）、氨氧化古菌（ammonia-oxidizingarchaea，AOA）、亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizingbacterium，NOB）以及厌氧氨氧化菌（Anammox）等，反硝化微生物主要包括好氧反硝化菌（aerobicdenitrifier）、自养反硝化菌（autotrophicdenitrifier）和反硝化聚磷菌（denitrifyingphosphate-removalbacterium，DPB）等。虽然反硝化被认为是污水处理N2O唯一的汇，但并不是所有反硝化菌都能够将硝酸盐完全反硝化为N2.很多反硝化菌由于缺乏氧化亚氮还原酶（nitrousoxidereductase，NOS），其反硝化只能进行到N2O这一步，这样就造成了N2O的积累和释放。典型缺乏NOS的反硝化细菌有红球菌属（Rhodococcus）、诺卡菌属（Nocardioides）和放线菌属（Actinomadura）等。如何提高具有NOS的反硝化菌活性和抑制缺乏反硝化还原酶系统的反硝化菌生长是缓解污水N2O释放的重要措施。
目前关于污水处理过程中削减N2O的释放策略主要围绕两个方面：一是通过调整运行参数降低N2O的产生；二是通过提高完全反硝化进程增加N2O的消耗。反硝化过程作为污水处理过程N2O的汇，具备更高的N2O减量化潜力，如何高效利用反硝化促进N2O的减量是研究热点。本文对污水生物处理过程中硝化和反硝化两个过程N2O产生机理及影响因素进行综述分析，探讨污水生物处理N2O减量策略，以期为缓解污水生物处理过程中N2O的释放理论研究与技术开发提供借鉴。
1、污水处理过程中产生N2O微生物的特性
污水生物处理系统中能够产生N2O的微生物种类有很多，不同类型的微生物产生N2O的方式会有所不同（表1）。
1.1 氨氧化细菌（AOB）
AOB是革兰氏阴性菌，化能自养型菌，属于变形菌门，可进一步分成α、β、γ、Δ和ε变形细菌。AOB能够产生氨单加氧酶（AMO）和羟胺氧化还原酶（HAO），可以利用AMO将铵根离子（NH4+）氧化为羟胺（NH2OH）后进一步利用HAO将NH2OH氧化为亚硝酸根（NO2-），具体反应如方程（1）（2）。AOB在硝化过程会因为NH2OH不完全氧化而产生N2O，AOB也能够进行反硝化作用，但是AOB不具备NOS编码基因，也就意味着AOB只能将硝酸盐还原为N2O而不能还原为N2，这会导致大量N2O的产生。
1.2 氨氧化古菌（AOA）
AOB并不是唯一能够进行氨氧化的微生物，AOA被证实具有氨氧化基因，也能够进行氨氧化。虽然AOA占比只有AOB的1/10到1/100，但是AOA适应环境的能力更强且分布更广泛，在低温或低溶解氧的极端环境条件下依旧能够发现AOA的存在。然而与AOB硝化作用不同，AOA并不含有HAO和细胞色素P460（cytP460），AOA氧化NH2OH的过程目前还不清楚。虽然现在还不明确AOA通过什么方式产生N2O，但是已经检测到其在硝化过程中产生了N2O。
1.3 厌氧氨氧化菌（Anammox）
厌氧氨氧化菌氨氧化作用不同于硝化作用的氨氧化，厌氧氨氧化菌利用亚硝酸盐作为电子受体氧化NH4+，以碳酸氢盐（HCO3-）或CO2作为碳源，最终产物为N2.由于厌氧氨氧化工艺是化能自养过程，不需要消耗外来有机碳源，所以被认为是一种更经济有效的污水脱氮技术，并被广泛用于处理高氨氮污水处理。虽然目前并无研究明确阐明厌氧氨氧化是如何产生N2O的，但是在厌氧氨氧化处理过程中检测到大量N2O的产生。
1.4 完全氨氧化菌（Comammox）
在完全氨氧化菌未被发现之前，人们一直认为微生物硝化过程是两种菌的两个过程，即NH4+首先被氨氧化菌氧化到NO2-，然后由NOB氧化NO2-到硝酸盐（NO3-）。但是2015年发表在《Nature》的一篇论文报道了完全氨氧化菌的发现，该菌能够独立将NH4+氧化为NO3-。完全氨氧化菌也会在硝化过程中通过NH2OH不完全氧化产生N2O，但其产生N2O的量低于氨氧化菌产生的量，与AOA产生的量相当。有文献指出完全氨氧化菌之所以产生较少的N2O是因为其能够独自将NH4+氧化为NO3-，中间避免了NO2-的积累，从而减少了N2O的产生和释放。
1.5 好氧反硝化菌
好氧反硝化菌在自然环境中分布广泛，且种类繁多，包括副球菌属（Paracoccus）、芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、不动杆菌属（Acinetobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、红球菌属以及卤单胞菌属（Halomonas）等。好氧反硝化菌属于异养反硝化菌，需要有机碳源提供电子，能够在好氧条件下在细胞周质中进行反硝化。好氧反硝化菌具有与缺氧反硝化菌同样的反硝化系统，但因好氧反硝化菌不需要严格缺氧环境，而且大多数好氧反硝化菌都可以进行硝化作用，这也就意味着好氧反硝化菌既能通过硝化过程的NH2OH不完全氧化产生N2O，也能通过反硝化产生N2O。
1.6 自养反硝化菌
自养反硝化细菌是化能自养型细菌，可以利用氢、硫化物或亚铁离子（Fe2+）作为电子供体进行反硝化，将硝酸盐还原为N2.由于其可以利用无机碳源作为电子供体进行反硝化，所以自养反硝化工艺被认为可以用于低碳氮比（C/N）污水的脱氮处理。虽然自养反硝化过程可以实现低有机物、高氨氮负荷运行，但是其过程同异养反硝化一样依然会产生中间产物N2O。而且有研究发现，硫化物或Fe2+驱动的自养反硝化过程会增加N2O的释放，主要原因是以硫化物为电子供体的自养反硝化的N2O还原速率相对较低。
1.7 反硝化聚磷菌（DPB）
DPB是一种可以兼顾反硝化脱氮和除磷的微生物，且其活性不受溶解氧的影响。DPB可以实现在一个细胞内利用碳源同时进行脱氮除磷，解决了传统脱氮除磷之间的碳源竞争和污泥龄（SRT）之间的矛盾问题，进而达到更经济更高效的脱氮除磷效率。虽然DPB在反硝化过程也会产生N2O，但是在足够碳源存在以及低亚硝酸盐浓度情况下，DPB能够有效降低N2O的释放。
2、N2O的形成机理
2.1 好氧硝化过程N2O形成机理
硝化细菌在好氧环境中可以利用HCO3-或CO2为碳源氧化NH4+生成NO2-和NO3-，在硝化过程中AOB和AOA将NH4+在AMO作用下氧化生成NH2OH，NH2OH在HAO作用下被氧化为NO2-，NOB利用亚硝酸氧化还原酶（NOR）将NO2-氧化为NO3-。在硝化过程中会造成NH2OH不完全氧化生成N2O，当受到环境及生物本身因素的影响时NH2OH会氧化为硝酰基（NOH），进而水解为N2O（图1）。AOB和AOA都能通过产生膜内酶AMO和膜外周质酶HAO进行氨氧化作用，其中编码AMO功能基因是amoA、amoB和amoC，编码HAO的功能基因是hao、cycA和cycB；NOB产生的NOR分为细胞周质NOR和细胞质膜NOR，编码NOR的功能基因为norA和norB。
在硝化阶段能够产生N2O的原因是NH2OH的不完全氧化，而参与这个过程的酶是HAO，HAO属于多血红素蛋白酶，每个单体含有7个电子转移血红素和1个催化血红素，存在于细胞膜外周质中。HAO单体之间通过Tyr残基和相邻亚基的催化血红素部分之间独特的双交联共价连接，而根据交联缺失情况可以分为氧化型HAOs和还原性HAOr，HAOr将NO2-还原为NO，也将NO和NH2OH还原为非生理底物。一直以来人们认为HAO直接将NH2OH氧化为NO2-，然而有研究认为HAO只能把NH2OH氧化为NO。铁离子（Fe2+、Fe3+）会促进HAO活性，且随Na+和K+的增加而增加，但是Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Ba2+均会抑制HAO活性。
2.2 缺氧反硝化过程N2O形成机理
在缺氧环境中，反硝化细菌利用有机碳源提供的电子还原硝酸盐最终生成N2，首先NO3-在硝酸盐还原酶（NAR）作用下被还原为NO2-，NO2-在亚硝酸盐还原酶（NIR）作用下还原为NO，NO在一氧化氮还原酶（Nor）作用下被还原为N2O，N2O在NOS作用下被还原为N2.反硝化过程既会产生N2O，也会消耗N2O，N2O产生与消耗的不平衡造成了N2O的积累（图1）。完全反硝化过程是由4种反硝化酶来完成的，其中编码NAR的基因是narGHJI；编码NIR的功能基因有两个，分别为nirK和nirS；编码Nor的功能基因为norBC；编码NOS的功能基因为nosZ。虽然大多数反硝化细菌具备完整的反硝化酶系统，但是电子分配的不均衡会致使N2O还原过程受阻，从而导致N2O的积累并释放。有一些反硝化细菌如红球菌属、诺卡菌属和放线菌属的菌株缺乏编码NOS基因，所以这些菌只能将NO3-还原到N2O这一步，这也就导致了N2O的释放。虽然反硝化过程会产生N2O，但是反硝化过程是现在唯一已知能够消耗N2O的过程。
在反硝化阶段能够影响N2O产生的酶有NAR、NIR、Nor、NOS这4种酶，其中Nor产生N2O，NOS还原N2O为N2，消耗N2O。细菌和真菌中含有的Nor是不同的，具有反硝化功能的真菌中的Nor属于细胞色素P-450一族，而反硝化细菌中的Nor表现出与血红素/铜细胞色素氧化酶相似的特征，且细菌中的Nor有两个分支，分别为喹啉（qNor）和细胞色素C。Nor利用铁作为其活性中心元素，将两个NO还原为一个N2O。与Nor不同，并不是所有反硝化细菌都含有NOS，如红球菌属、诺卡菌属和放线菌属的多数菌株，这也是造成N2O积累释放的原因之一。Zumft等人在1982首次提纯了NOS，并鉴定其为多铜蛋白。NOS具有两个Cu活性中心，分别为双核CuA中心和硫化物桥接的四核铜中心（CuZ）组成的六铜原子双中心酶。NOS作为反硝化过程的最后一个酶，也是降解N2O唯一已知的酶，其对于减少污水处理过程中N2O的释放至关重要。
2.3 其他过程N2O的形成
除了硝化过程和反硝化过程会产生N2O外，在厌氧氨氧化系统中也检测到了大量N2O气体产生，但是现在并没有直接的证据证明厌氧氨氧化过程会产生N2O（图1），而且到目前为止还无法通过纯培养技术获得单一厌氧氨氧化菌，这也就意味着验证厌氧氨氧化过程能否产生N2O以及如何产生N2O会更加困难。
3、N2O减量策略
N2O减量化策略主要是针对影响N2O产生和释放因素进行优化调整，最终实现N2O减量（表2）。除了传统的生化分析外，组学手段也被广泛应用于N2O减量策略的分析研究。
3.1 优化工艺参数
不同污水处理工艺产生N2O的情况不同，有研究表明相较于A/O工艺和SBR工艺，氧化沟工艺产生的N2O更少。虽然利用SBR反应器处理污水能够高效去除COD并且能够同时脱氮除磷，但是其好氧阶段会产生大量N2O，有研究表明通过取消厌氧阶段和延长闲置时间保障了生物营养物质去除的同时减少了N2O的释放。缺氧反硝化过程虽然能够将N2O还原为N2，但是也被观察到N2O大量释放的情况，而延长缺氧阶段的水力停留时间被认为能降低N2O的积累。
C/N会严重影响异养反硝化过程，低C/N会降低反硝化速率，原因在于异养反硝化过程需要碳源来提供电子，NOS无法获得充足电子而失活，增加N2O的积累，所以提高C/N将有利于缓解N2O的释放。进水C/N也会影响好氧硝化过程N2O的释放，进水C/N越低N2O释放量也会越高。有研究发现在短程硝化过程中，随进水氨负荷增加，N2O的释放也会随之增加。微生物代谢不同类型碳源的速率不同，产生电子能力不同，从而导致添加不同碳源下异养反硝化过程N2O的释放量有所不同。研究表明乙酸作为碳源较乙醇会产生更多的N2O，甲醇作为碳源比其他长链碳化合物更适合减少N2O释放。
溶解氧会影响N2O的产生，低溶解氧会导致好氧硝化过程NH2OH不完全氧化，造成N2O的产生，但也有研究表明短期低溶解氧会造成N2O增加，而经长期低溶解氧驯化后，AOA/AOBamoA基因丰度增加，降低了N2O的产生。氧的存在会抑制NOS活性，从而造成N2O积累，所以在缺氧到好氧过渡阶段会导致大量N2O释放。可以通过控制溶解氧来调节反硝化细菌、AOB和NOB丰度，当溶解氧为1.6mg/L时，增加了反硝化细菌和NOB丰度，缓解了N2O释放。所以在污水处理工艺中控制溶解氧对于缓解N2O的释放意义重大。
提高温度对好氧硝化过程N2O的释放有积极的作用，温度升高会直接促进N2O的释放。温度还会影响反硝化酶活性，温度越低反硝化酶活性越低，温度升高会提高反硝化速率，同时降低N2O的积累。
pH值也会影响硝化过程N2O的释放，研究表明高pH值（7.5-7.6）下N2O释放量低于低pH值（6.6-7.1）释放量。pH值也会影响NOS活性，在pH值为6.5-8范围内，NOS活性随pH值升高而增加，也就意味着高pH值有利于降低N2O的释放。
污泥龄的长短是保持活性污泥活性的重要参数，污泥龄太短将导致世代时间长的微生物难以成为优势种属。有研究表明，污泥龄越长将产生更少的N2O，因为污泥龄长的系统具有更高的NOS基因丰度，所以延长污泥龄将有助于增加含NOS基因的反硝化细菌比例。
3.2 调整微生物群落结构
无论是硝化过程还是反硝化过程都是由微生物完成的，所以优化微生物结构也将有利于缓解N2O的产生和释放，也就意味着增加具有完整反硝化酶系统的反硝化细菌丰度或减少缺乏NOS基因的反硝化细菌丰度也必定有利于缓解N2O的释放。16SrRNA基因测序和宏基因组测序技术的应用帮助了研究人员对微生物种类及微生物群落结构变化的认识，促进了对污水处理过程中微生物产生N2O机理的研究。在很多关于N2O减量的研究中发现，有效的减量化措施都会导致具有完整反硝化酶系统的反硝化细菌丰度增加，而在N2O增加的措施中缺乏NOS基因的反硝化细菌会增加。也有研究发现添加具有N2O消除能力的细菌或者驯化富集具有能够消除N2O的菌群能够有效缓解N2O的积累。虽然现在关于通过优化微生物群落结构缓解N2O释放的策略很少，但是所有缓解策略的结果都导致了微生物群落结构的变化。
3.3 提高完全反硝化酶活性
NOS是反硝化最后一步的酶，也是消耗N2O的酶，如果能够提高NOS活性，促进N2O的还原必然也会减少N2O的释放。NOS含有两个由6个铜原子组成的双催化中心，通过添加铜离子（Cu2+）可以促进NIR和NOS的活性，减少亚NO2-积累的同时促进了N2O的消耗，实现N2O的减量排放。
生物炭被广泛用于土壤中N2O的减量，也用于促进污水反硝化细菌活性。在生物炭表面含有大量氧化还原基团，这些活性基团会促进反硝化细菌外源碳代谢，调节电子分配，促进反硝化还原酶活性，提高了N2O的消耗。石墨烯被认为是一种具有革命性的材料，具有极强的电子传递能力，可以促进反硝化过程中电子生成和传递，从而促进含铁酶的活性，减少N2O的释放。
4、小结与展望
在污水生物处理过程中N2O产生于NH2OH不完全氧化和反硝化中间产物。现在普遍认为反硝化过程是主要的N2O贡献途径之一，但是反硝化也是N2O唯一的汇，所以如何控制好反硝化过程将对缓解N2O至关重要。现在的研究多通过对污水处理工艺参数的优化来缓解N2O的释放。酶学、宏基因组等手段也被不断用于探索N2O形成机理及影响因素，以寻找更加合理的方法减少N2O的排放。
本文总结了污水生物处理过程中参与产生N2O的微生物、微生物氮转化过程中N2O产生的机理、影响N2O生成的酶及现阶段N2O减量化策略。现阶段对于污水生物处理过程中N2O生成机理和微生物群落结构对N2O积累的影响仍然没有清晰的认识，还需要进一步研究。
（1）污水中排放的N2O最原始来源始终是污水中的化合态氮（有机氮、氨氮、硝态氮），所以对氮元素管理尤为重要。但是大多N2O减量化策略都停留在实验室阶段，在实际工程应用中并没有得到广泛应用，究其原因是当前对N2O排放管控不严格、实际应用的污水处理工艺改造成本高、多数N2O减量化策略成本增加、可能会导致出水水质变差等问题。
（2）如何直接调节微生物群落结构以减少N2O排放现在还是个挑战，但是很多研究表明微生物群落结构优化有助于缓解N2O的释放。能够筛选出具有强N2O还原能力的微生物将有助于N2O的减量。
（3）完全反硝化过程是N2O的汇，如何促进完全反硝化过程是N2O汇发挥作用最根本的问题，然而反硝化是个复杂的过程，如何富集含有完整反硝化系统微生物以及调节各个酶之间的相互作用是一件困难的事情，但是完全反硝化过程终究是消耗污水生物处理过程中N2O唯一的途径，值得研究人员深入研究。（来源：农业农村部成都沼气科学研究所，农业农村部农村可再生能源开发利用重点实验室）