抗生素选择压力下短程硝化反硝化工艺微生物群落特征
近年来，抗生素已广泛用于治疗人类微生物感染、促进畜禽动物生长及病害防治等方面，据调查显示，2013年我国抗生素总产量为24.8万吨，总使用量约为16.2万吨，已成为世界上最大的抗生素生产国和消费国；其中48%用于人疾病治疗与预防，52%用于动物。与其他环境污染物不同，多种抗生素不能被完全代谢或消除。释放到环境中的抗生素作为一种选择压力，促进抗生素抗性基因（ARGs）和抗生素抗性细菌（ARBs）的出现和传播，从而增加公共卫生风险的发生概率。目前，ARGs和ARBs已经成为一个全球公共卫生问题。
释放到环境中的抗生素可从不同途径进入污水处理厂，通常可达ng/L-µg/L水平，众多研究表明，废水中抗生素的存在会显著改变微生物群落结构和影响污染物去除效果。如在A/O-MBR工艺中，100µg/L四环素（TC）和磺胺甲恶唑（SMX）对污染物的去除无影响，但当TC和SMX浓度为1000µg/L时，该工艺的总氮去除能力下降，出水硝酸盐浓度显著提高，且TC和SMX暴露改变了细菌群落结构，显著降低了微生物多样性。在序批式反应器（SBR）中，微生物多样性随TC和SMX浓度的升高而降低。此外，Matos等报道称，在序批式生物膜反应器中50µg/L的TC暴露引起细菌群落的显著变化。类似的研究表明，50mg/L的TC引起了微生物群落结构的显著变化，从而使TC抗性细菌，如Arthrobactersp。和Diaphorobactersp。逐渐演变为优势类群。此外，Wan等在研究不同浓度磺胺嘧啶（SD）存在条件下好氧颗粒污泥微生物群落变化时发现，SD改变了污泥的微生物群落结构，并且不同浓度富集了相应优势细菌。由此可知，深入研究抗生素选择性压力下微生物群落结构响应情况，可为污水处理系统中菌群调控与抗生素的控制提供理论依据。
与传统脱氮工艺相比，短程硝化反硝化工艺具有减少40%的碳源、节省25%的曝气能耗等优势，已成为国内外研究热点。然而，短程硝化反硝化易受到各种环境因子的影响导致亚硝氮难以稳定积累，如周等通过溶解氧（DO）和pH实时控制实现短程硝化反硝化，但随着曝气时间的增加亚硝氮积累率呈下降趋势，且活性污泥中氨氧化菌（AOB）和亚硝酸盐氧化菌（NOB）是动态变化的。穆等通过调控pH、DO等参数促进AOB增殖，抑制NOB生长，从而实现短程硝化反硝化，由于参数控制对微生物群落的筛选作用，Chloroflexi、Bacteroidetes和Proteobacteria成为污泥中的优势菌门。由此可知，该工艺的脱氮性能主要受系统中微生物活性与菌群组成的驱动，作为重要的环境因子，目前关于抗生素选择性压力下短程硝化反硝化工艺中微生物活性与菌群如何响应还缺乏系统研究。基于此，本研究主要考察典型抗生素TC和SD作用下SBR系统的脱氮性能，分析了TC和SD暴露对活性污泥胞外聚合物（EPS）、比耗氧速率（SOUR）的影响，重点解析了系统中微生物群落结构的动态演替规律。本研究结果不仅有力扩充了抗生素选择压力下短程硝化反硝化工艺的脱氮性能和微生物生理生化动态变化情况，同时深入研究了抗生素选择性压力下微生物群落结构响应规律，可为短程硝化反硝化工艺的实际应用提供理论基础。
1、材料与方法
1.1 模拟生活污水
本研究处理的污水为模拟生活污水，无机盐培养基、微量元素的组成均参照本实验室前期配方：氮源为硫酸铵，碳源为葡萄糖。由于TC和SD使用量大，在废水中检出率高，因此，本研究将TC和SD作为目标抗生素。SD购于阿拉丁公司（纯度为98%），TC（生物技术级）购于麦克林公司，TC和SD配制成母液储存于棕色瓶中4℃保存。
1.2 SBR反应器的设置与运行
采用实验室规模序批式反应器（SBR，有效容积为25L）处理模拟生活污水，通过运行参数的控制启动短程硝化反硝化，具体运行参数与进水水质设置如表1所示。反应器连续运行151d，其运行周期设置为280min：进水30min，曝气120min，缺氧60min，曝气30min，沉淀30min，出水10min。接种物取自某市政污水厂曝气池处理单元的活性污泥,并在实验室驯化一段时间，驯化的培养基为高氨氮培养基，氨氮浓度约为200mg/L，其他成分与模拟生活污水一致，驯化后污泥的平均氨氧化速率达23.7mgL-1h-1，且保持较高的亚硝氮积累率。
为了考察抗生素选择压力对短程硝化反硝化工艺的影响，本试验分两个阶段运行，阶段一（1-105d）：短程硝化反硝化工艺的启动与稳定运行。根据设置的参数运行反应器，并根据COD、NH4+-N、TN去除情况以及亚硝氮积累率判断短程硝化反硝化的启动与稳定运行情况，此阶段不添加抗生素。阶段二（106-151d）：抗生素选择性压力阶段，主要考察抗生素添加对短程硝化反硝化工艺性能的影响，其中TC和SD的投加浓度分别为100µg/L。
1.3 SOUR与EPS测定
SOUR作为考察微生物代谢活性的一个重要指标，从微生物呼吸速率角度反映了活性污泥生理状态和基质代谢状况。本研究分别于阶段一（第61天、87天、105天）和阶段二（第116天、126天、136天、151天）使用便携式溶解氧探头连续监测DO来评估，SOUR是使用Depletion线（作DO-时间t的曲线）的斜率除以污泥浓度（MLSS）来计算，每个样品设置3个平行。
为了考察抗生素胁迫对活性污泥EPS组成的影响,分别于阶段一（第26天、87天、105天）和阶段二（第116天、126天、136天、151天）采集活性污泥样品用于EPS的测定。EPS提取采用热提取法。EPS中主要组分多糖（PS）与蛋白（PN）的测定方法分别为BCA法与苯酚-硫酸法。
1.4 微生物群落结构分析
分别于阶段一（第61天、105天）和阶段二（第126天、151天）中从SBR中收集活性污泥样品进行微生物群落分析。采集适量SBR中的泥水混合液样品，5000r/min离心10min（4℃），弃上清液收集污泥样品于2mL无菌无酶离心管中，放置于-80℃冰箱保存，每个样品3个平行。各阶段对应的样品名称分别为YR2-1、YR2-2、YR2-3、YR2-4。
1.4.1 DNA提取和PCR扩增
取污泥样品0.25g，用E.Z.N.A.®soilDNAkit（OmegaBio-tek，Norcross，GA，U。S。）试剂盒对污泥样品进行总DNA提取，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16SrRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序如下：95℃预变性3min，27个循环（95℃变性30s，55℃退火30s,72℃延伸30s），然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存（PCR仪：ABIGeneAmp®9700型）。
1.4.2 IlluminaMiseq测序与数据处理
使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrepDNAGelExtractionKit（AxygenBiosciences，UnionCity，CA，USA）进行回收产物纯化，纯化后的PCR产物利用Illumina公司的MiseqPE300平台进行测序（上海美吉生物医药科技有限公司）；使用fastp软件对原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接，然后使用UPARSE软件根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体，利用RDPclassifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva16SrRNA数据库（v138），最后通过查阅文献确定系统中硝化和反硝化菌属。
1.5 常规指标检测
MLSS、NH4+-N、NO2--N、NO3--N、COD、TN均采用国家标准方法测定，pH和DO分别采用PHSJ-3F型雷磁pH计和DZB-712型雷磁便携式溶氧仪检测。
1.6 亚硝氮计算公式如下：
亚硝氮积累率=［NO2--N］/（［NO2--N］+［NO3--N］）
2、结果与讨论
2.1 抗生素对短程硝化反硝化去除性能的影响
如图1所示，在阶段一（1-105d），经过20d的调试后，亚硝氮平均积累率为93.72%，说明反应器启动成功。出水TN、COD、NH4+-N的均值分别为13.19mg/L、29.12mg/L、4.53mg/L，平均去除率分别为69.73%、89.67%和88.96%。第21-105天为稳定运行阶段，TN、COD、NH4+-N的平均去除率分别为66.31%、88.90%、90.35%，SBR反应器出水均可达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》（GB18918-2002）一级A标准。出水亚硝氮均值为6.61mg/L，亚硝氮积累率一直保持在较高水平（平均值为85.30%），表明在低氨氮浓度条件下，通过运行参数的合理控制，可以实现稳定的短程硝化反硝化效果。
阶段二（106-151d）投加100µg/LTC和SD后，系统出水TN、COD、NH4+-N的均值分别为8.30mg/L、23.08mg/L、2.41mg/L，平均去除率分别为73.72%、90.42%、92.48%；出水亚硝氮均值为3.98mg/L，亚硝氮仍保持较高的积累率，为82.61%。与阶段一相比，添加抗生素对TN、COD、NH4+-N去除无明显影响（图1），这与前人的研究结果一致,如Zhang等研究表明,与未投加TC阶段相比，投加100-500μg/L的TC后系统中的COD和NH4+-N去除效果无显著变化。Collado等也发现50µg/L的SMX对SBR中有机物去除和脱氮效率几乎无影响。有研究指出，未发现50µg/LTC显著影响有机物的去除和硝化活性。此外，我们研究发现，100µg/LTC和SD选择压力对出水NO3--N的也几乎无影响，其由阶段一的1.54mg/L降低为阶段二的1.24mg/L。在短程硝化反硝化系统中，虽然未发现100µg/LTC和SD暴露显著影响污染物的去除，但抗生素暴露是否会影响微生物群落结构应进一步研究。
2.2 短程硝化反硝化中SOUR与EPS变化
如图2所示，阶段一（第61天、87天、105天）和阶段二（第116天、126天、136天、151天）检测到的短程硝化反硝化工艺中活性污泥的SOUR值（O2/MLSS）分别为7.6、7.0、10.7和12.5、12.3、12.3、11.6mgg-1h-1,平均SOUR分别为8.44和11.98mgg-1h-1，阶段二中的SOUR较阶段一提高了41.9%，说明100µg/LTC和SD增强了短程硝化反硝化系统中微生物的活性，这与Zhang等研究发现的TC暴露在μg/L水平可以增强好氧颗粒污泥微生物呼吸活性的结论一致。系统中的SOUR在第116天时达最大值12.5mgg-1h-1，随后随着抗生素暴露时间的延长而呈缓慢下降趋势，到第151天时降至11.6mgg-1h-1，可能的原因是长时间运行使得污泥表面吸附大量抗生素，对微生物的活性产生了一定的抑制作用。
EPS在促进微生物聚集体形成、提升反应器污泥浓度、提高污染物去除效果、抵抗冲击负荷以及在恶劣环境下保护微生物等方面发挥着重要作用，同时，EPS也是决定活性污泥理化性质和生物活性的关键组分。如图3所示，在抗生素存在下，PN浓度从第105天的39.7mg/gMLSS逐渐增加到第116天的46.8mg/gMLSS；PS浓度从第105天的18.5mg/gMLSS逐渐增加到第116天的23.6mg/gMLSS。且在第15天时，PN浓度达最大值（63.5mg/gMLSS），PS则在第136天达最大值（32.8mg/gMLSS）。TC和SD的添加促进了微生物EPS的分泌，在细胞外形成网状结构，从而保护自身免受抗生素的毒性作用。研究发现在SBR反应器中，PN和PS含量随着土霉素投加浓度的增加而增加。在本研究中，蛋白含量明显高于多糖含量，这与Zheng等的研究结果一致，可能是因为在抗生素存在条件下，微生物的蛋白质分泌代谢比多糖分泌代谢更敏感。
2.3 微生物群落变化
2.3.1微生物多样性分析
如表2所示，第61天到第105天的ACE指数和Chao1指数呈上升趋势。此外，通过比较Simpson和Shannon指数，发现第105天的多样性高于第61天，说明在阶段一，活性污泥中微生物群落丰富度和多样性均随着运行时间的增加而增加，且微生物多样性在第105天时达到最大值。第105天、126天、151天样品的ACE指数和Chao1指数呈下降趋势，样品的Shannon指数逐渐降低，Simpson指数逐渐增加，说明在100µg/LTC和SD选择压力下微生物的丰富度和多样性均降低。
2.3.2 门水平微生物群落变化
图4a显示了在短程硝化反硝化系统活性污泥样品中门水平上优势类群的分布，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria是所有活性污泥样品中含量最丰富的3个门，通常在污水处理系统中发现，并且Proteobacteria是一类典型异养菌，通常存在于好氧生物处理系统中。第105天时，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria的相对丰度分别为37.11%、28.74%、15.56%。Patescibacteria在第61天的相对丰度为85.15%，但随着运行时间的延长，第105天其相对丰度下降至37.11%。连续暴露于TC和SD导致活性污泥微生物群落显示出明显的变化，Patescibacteria的相对丰度降至27.49%，这表明它们可能容易受到抗生素的负面影响。Proteobacteria增加到18.26%，Actinobacteriota增加到35.23%，这与之前的研究结果类似，可能是抗生素暴露导致了一些对抗生素产生抗性的微生物增殖的结果。因此，抗生素选择性压力对短程硝化反硝化工艺活性污泥中抗生素抗性基因（ARGs）传播的影响还需要进一步研究。
2.3.3 属水平微生物群落变化
各阶段反应器中的优势菌属为TM7a和Tessaracoccus（图4b）。TM7a的相对丰度从第105天的12.56%升高至第151天的14.0%，其相对丰度变化不大且有增加的趋势，说明TM7a对100µg/L的TC和SD的胁迫具有较好的抗性。Tessaracoccus是一类兼性厌氧菌，存在于活性污泥、海底沉积物、被油污染的含盐土中，对环境的适应能力较强。在本反应器中Tessaracoccus的相对丰度从第105天的5.38%增加第151天的14.76%，从而逐渐成为优势菌属，这与李新慧等研究结果一致。
如表3所示，Nitrosomonas是短程硝化反硝化系统中丰度最高的AOB，抗生素胁迫对Nitrosomonas产生不利影响，其相对丰度从第105天的0.093%下降至第151天的0.062%。Ellin6067是该系统中的另一类AOB，在100µg/LTC和SD选择压力下，其相对丰度呈上升趋势，说明该菌对抗生素胁迫具有较好的适应性。同时，反应器中仍存在一定丰度的NOB，且在整个运行过程中呈上升趋势，但出水NO3--N略有降低（图1B），说明在短程硝化反硝化工艺中，NOB并没有被完全淘汰，只是其活性受到了一定的抑制作用。相比之下，Nitrosomonas较Ellin6067与Nitrotoga对TC和SD的胁迫冲击更为敏感。总体而言，AOB的相对丰度在各阶段污泥样品中均较低（<0.12%），但氨氧化性能良好（NH4+-N去除率>90%）（图1A），这与前人的研究结果一致。因此，今后的研究需要在脱氮功能基因水平上对AOB进行更深入的了解。
如图4c所示，Rhodobacter和Thauera是反应器中相对丰度较高、典型的反硝化细菌。Thauera是一类硝酸盐还原菌，具有代谢多种芳香族化合物的能力且常在污水处理系统中被检出。而Rhodobacter是污水处理厂中一类潜在的反硝化细菌。在第105天，Thauera和Rhodobacter的相对丰度分别为0.32%、0.74%，第151天时两者丰度分别上升至0.36%和4.8%，说明100µg/LTC和SD暴露对Thauera和Rhodobacter的生长具有促进作用。此外，皮尔森相关性分析结果表明，Rhodobacter与TN去除率显著正相关（P<0.01），说明Rhodobacter对TN的去除发挥了重要作用。
3、结论
（1）100µg/L的TC与SD添加对短程硝化反硝化系统中NH4+-N和COD的去除几乎无影响，出水TN、NH4+-N和COD等指标均可达排放标准；抗生素选择压力下，微生物EPS与SOUR值升高，从而提高了系统的抵御能力，维持了稳定的脱氮性能。
（2）TC与SD胁迫下微生物多样性与丰富度均降低，门水平上，Patescibacteria、Actinobacteriota和Proteobacteria是主导微生物；属水平上，TM7a和Tessaracoccus是优势菌属。在100µg/L的TC与SD选择压力下，TM7a和Tessaracoccus的相对丰度均呈上升趋势。此外，TC与SD的存在促进了反硝化菌Thauera和Rhodobacter的富集，Rhodobacter可能对于TN的去除发挥了重要作用。
本研究考察了100µg/LTC和SD选择性压力下短程硝化反硝化工艺的脱氮性能及微生物群落结构响应规律，TC与SD持续暴露对短程硝化反硝化工艺去除性能几乎无影响，系统中微生物群落发生了显著变化以适应抗生素的选择压力。以上研究结果深化了我们对于抗生素胁迫下短程硝化反硝化工艺脱氮性能与微生物群落演替规律的认识，可为短程硝化反硝化工艺的实际应用提供理论基础，但抗生素选择性压力对短程硝化反硝化工艺活性污泥中ARGs传播的影响还需要进一步研究。（来源：中国科学院成都生物研究所，中国科学院环境与应用微生物重点实验室，四川省环境微生物重点实验室，中国科学院大学）