豆瓣生产污水中微生物降解氨氮

　　水体富营养化现象已成为世界上重要的水环境污染问题，富营养化通常指在人类活动的影响下，生活污水、化肥和食品等工业废水、降水以及地表径流中含有的大量氮、磷及其他无机盐等植物营养物质输入水库、湖泊、河流等缓流水体后，引起藻类及其他浮游生物的迅速繁殖，水体溶解氧下降，水质恶化，鱼类及其他生物大量死亡的现象。随着工业生产规模的迅速发展，人类每天向自然界中排放大量富含氮磷的工业废水，这些废水如不经过处理排入水体中，就增加了水体中营养物质的负荷量，导致水体富营养化

　　目前，我国许多食品企业存在规模小、技术落后、废水排放量大等问题，而企业又无能力建设符合标准的环保处理装置，其直接后果就是将废水直接排放，污染江河湖海水体环境。以豆瓣企业为例，每年排放的废水超过1.3亿吨，而且传统的豆瓣企业都是从家庭作坊式发展起来的，有废水处理装置的企业不多，因此在传统企业向现代化企业转型的过程中，豆瓣企业的废水处理的环保处理装置和技术也需要转型。研究发现食品企业的废水中有机物含量比较高，经过物理、化学等方法多级处理后，剩下高浓度氨氮的废水处理最经济有效的方法为微生物降解处理，其核心问题在于微生物菌种。因此，本文从豆瓣企业污水中筛选高效降解氨氮的土著微生物菌种，制作微生物菌剂，通过微生物强化技术解决豆瓣企业等食品企业的污水处理问题。

　　一、材料与方法

　　1.1 样品

　　分别从鹃城、丹丹、扬名食品、清香园等四川省著名品牌的豆瓣生产企业采集生产污水，采用微生物实验技术分离、筛选其中的土著微生物作为氨氮降解实验研究的出发菌种。

　　1.2 实验试剂

　　蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、六水合氯化亚铁、氯化钙、七水合硫酸镁、琥珀酸钠、酵母浸出物、硫酸锌、氢氧化钠、盐酸、氧化镁、溴百里酚蓝、硼酸、甲基红、甲基橙、亚甲蓝、碳酸钠，以上试剂均为分析纯。

　　1.3 实验仪器

　　三角瓶、烧杯、试管、容量瓶、平板、移液器枪头、移液器、灭菌锅、超净工作台、摇床、分光光度计、凯氏烧瓶、直形冷凝管、酸碱滴定台、离心机、干燥箱、电磁炉、电子天平、真空冷冻干燥机

　　1.4 培养基

　　富集培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

　　分离培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，氯化钠5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂18-20g/L，pH7.0，121℃灭菌20min。

　　种子培养基：硫酸铵1g/L，磷酸二氢钾1g/L，六水合氯化亚铁0.5g/L，氯化钙0.2g/L，七水合硫酸镁1g/L，琥珀酸钠8.5g/L，121℃灭菌20min。

　　发酵培养基：硫酸铵3.9g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁1g/L，琥珀酸钠2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃灭菌20min。

　　1.5 分离方法

　　1.5.1 微生物菌种的富集

　　按照5%的比例取混合均匀的水样加入富集培养基中，28-30℃、180r/min摇床富集培养18-24h。

　　1.5.2 微生物菌种的分离、筛选

　　吸取上一步富集好的菌液，采用梯度稀释的方法接种于分离平板上，28-30℃培养箱静置培养，待单菌落长出，挑选形态差异的单菌落且在新的培养基上划线，反复挑单菌落和平板划线的操作，直至单菌落为一种微生物，挑选单菌落接斜面培养基培养、保藏。

　　1.5.3 微生物菌种的保藏

　　对筛选到的菌种进行编号，制作真空冷冻干燥管保藏。

　　1.6 微生物发酵

　　种子培养基：挑选斜面培养的单菌落接种到种子培养基中，于28-30℃、180r/min条件下摇床中震荡培养18-24h，绘制其生长曲线。

　　发酵培养基：接种活化好的种子菌液，于摇床中震荡培养。分别对菌种、接种量、pH值、温度、转速(通氧量)等单因素条件进行优化。挑选氨氮降解性能优良的土著微生物菌种，按不同比例混合进行发酵培养，优化发酵条件。

　　1.7 水质指标检测

　　测定氨氮的方法主要为纳氏比色法和蒸馏―酸滴定法，本文采用蒸馏―酸滴定法测定微生物对氨氮的降解效果。

　　二、结果与分析

　　2.1 不同豆瓣企业生产污水的指标差异分析

　　从鹃城、丹丹、扬名食品、清香园等四川省著名品牌的豆瓣生产企业采集生产污水样品，分别命名为JC、DD、YM、QXY。依次检测4种水样的pH值、氨氮浓度、TP浓度、COD值等指标，为模拟实验环境下污水的水质条件，进行微生物菌种的发酵实验，以及对筛选的菌种进行驯化。从表1可以看出，豆瓣企业的生产污水的几个主要污染指标分别为：pH值5-7，氨氮浓度0.1-1.0g/L，TP浓度0.1-1.0g/L，COD浓度3.0-10.0g/L。以此为依据，设计豆瓣土著微生物菌种的发酵培养基为：硫酸铵3.9g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水合硫酸镁1g/L，琥珀酸钠2.8g/L，pH值6.5-7.5，121℃灭菌20min。

　　2.2 不同豆瓣企业生产污水中土著微生物的差异分析

　　选取进入中国地理标志品牌的郫县豆瓣品牌企业作为研究对象，分别从郫县鹃城豆瓣有限公司(鹃城)、四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司(丹丹)、成都扬名食品有限公司(扬名食品)和四川清香园调味品有限公司(清香园)收集生产污水水样，包括污水处理池进水、曝气池、厌氧池、出水等水样各3份。采用传统的梯度稀释、平板分离的方法，共收集70多株微生物菌株。经过光学形态鉴定和16SrDNA分子鉴定，如表2和图1中结果，鹃城、丹丹、扬名食品、清香园生产污水中的微生物数量分别为15种、19种、17种和14种，其中芽孢杆菌属占比最大。

　　2.3 土著微生物发酵降解氨氮实验

　　根据发酵预实验的结果，挑选了JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等共5株氨氮降解效果好的土著微生物菌种作为出发菌种，绘制其生长曲线，如图2所示，5株土著微生物菌种的活化种子液浓度都是在10-15h之间达到最大值，以此活化土著微生物菌种，进行发酵实验。

　　由表3可知，筛选的JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌种发酵降解氨氮的效果比较显著，预实验条件下的氨氮降解率都在80%及以上，经过16SrDNA分子生物学鉴定，分别为解鸟氨酸拉乌尔菌、纤维素菌属、地衣芽孢杆菌、不动杆菌属和假单胞菌属。由图3可知，土著微生物的降解氨氮效果大多数比较低，基本上都小于70%，离项目预期应用的90%降解率还有一定距离，因此，对5种土著微生物菌种进行协调发酵，探索复合菌剂发酵对氨氮降解效果的影响。

　　2.4 复合微生物菌剂提高降解氨氮效果实验初探

　　由表4和图4可知由JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3等5株土著微生物菌种按照1∶1∶1∶1∶1比例混合的复合微生物菌剂F1，其发酵降解氨氮的效果较之前的单一菌种发酵有显著的提高，氨氮降解率达到93.75%，分别较单一菌种发酵降解氨氮的效率提高了8%、32%、65%、15%和24%。

　　三、结论

　　从豆瓣企业生产污水中分离、筛选的解鸟氨酸拉乌尔菌、纤维素菌属、地衣芽孢杆菌、不动杆菌属和假单胞菌属等5株土著微生物菌株，编号分别为JCFXH2、JCGH4、DDFXH1、YMFXH3和QXYFXH3，都具有显著的氨氮降解效果，但离工业化污水处理菌剂还有差距，以该5株土著微生物菌种开发的复合微生物菌剂在氨氮降解效果上有明显的改善，氨氮降解率达到93.75%，具有很好的应用潜力。（来源：四川省食品发酵工业研究设计院）